核酸脂质体纳米粒LNP介绍及其制备方法
1. 什么是核酸脂质体纳米粒LNP
脂质体(Liposome)最早在1961年由科学家Alec Douglas. Bangham 和 R. W. Horne在显微镜下发现。脂质体是由脂质分子组成的囊泡结构,其脂质双分子层形成疏水外壳和内部的水相空腔,兼具亲水和疏水特性。脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle,LNP)是使用脂质形成纳米微粒的一种。在过去,科研人员通常使用脂质纳米粒直接包裹化学药物,在基因治疗领域,研究人员开始使用脂质纳米粒包裹核酸,如mRNA、siRNA、pDNA等,称为核酸脂质纳米粒。
针对Covid-19新型冠状病毒的mRNA疫苗开发,从病毒序列到成功上市只用了短短一年不到的时间。这在从前是无法想象和实现的。在这次针对Covid-19新型冠状病毒的mRNA疫苗上,莫德纳(Moderna)采用了自主开发的可电离脂质SM-102,而辉瑞和BioNTech则从Acuitas公司获得了一种名为ALC-0315的可电离脂质的许可。
mRNA分子由于疫苗的关系为大众所认识,但是很多人却不知道mRNA疫苗的幕后功臣,甚至可以说是整个机理的关键所在,是将mRNA封装并且安全有效地送进机体细胞的脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle,LNP)。从技术上来讲,核酸药物的研发主要有三个壁垒:第一个是原料端,包括mRNA原料序列的筛选和修饰;第二个是递送系统;第三个是整个药物的生产工艺。目前采用微流控技术产生脂质纳米颗粒(LNP), 将mRNA包裹在LNP 纳米颗粒中,再进入人体, 是FDA唯一批准上市的mRNA传递技术,并且已经在世界各地注射上亿剂的mRNA新冠疫苗中采用,其技术的安全性和有效性已经在这次全球的新冠疫情中得到验证。
2. 核酸脂质体纳米粒LNP的作用机理
在包裹核酸的脂质纳米粒配方中,起关键作用的是可电离脂质。例如Onpattro中的Dlin-MC3-DMA(简称MC3),其pKa值在6.3-6.5 之间,这个特性让它在血清的环境中表面电荷基本为中性,有利于细胞将带有核酸片段的脂质纳米粒整个吞进细胞内,形成胞内体(endosome)。 一旦进入细胞后,胞内体的酸性环境使电离脂质的头部质子化并带正电荷,从而与胞内体的内膜融合,释放目标核酸到细胞中发挥作用。
图1 核酸脂质体纳米粒LNP的作用机理
3. 核酸脂质体纳米粒LNP制备方法
最适合的技术还是采用微流控混合技术来制备核酸脂质纳米粒,该方法相对简便快速,条件温和,同时容易实现生产放大。微流控技术基本原理:将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后,将两相溶液注入制备系统的两条入口通道,一端是RNA的水溶液,一端是脂质的乙醇溶液,通过两相的快速混合,完成核酸脂质纳米颗粒的合成。 改变流体注入速度和比率,可以控制脂质纳米颗粒的粒径大小。将各种脂质溶解在乙醇中,mRNA溶于酸性水缓冲液中,将两相快速混合。通过稀释乙醇相,脂质的溶解度降低,在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒,同时高效包载mRNA。再经缓冲液膜包超滤或者透析除去残留的乙醇,中和缓冲液的pH值。
4. 制备核酸脂质体纳米粒LNP的微流控芯片结构
利用微流控芯片技术制备核酸脂质体纳米粒LNP主要是实现充分的混合,常采用鱼骨结构。芯片中鱼骨结构区域使流经的液体产生混沌流动,大大提高了液体的混合效率,比传统的搅拌混合均一性好,从而在芯片的出口处快速产生均匀的流体。其中的鱼骨结构可以是凸起(如图2所示),也可以是凹陷(如图3所示),制备效果跟体系有关,其粒径大小主要跟流速比有关。
图2 鱼骨结构凸起
图3 鱼骨结构凹陷
目前高校研究所及部分公司客户尚处在核酸脂质体纳米粒LNP的配方开发阶段,常选用带鱼骨结构的PDMS芯片进行研究,一方面是因为PDMS材质的芯片加工周期短,成本低,另一方面是因为PDMS芯片的特性使得实验参数更易获得。以下3款核酸脂质体纳米粒LNP制备微流控芯片是研究者经常使用的。
图4 ZX-LS-11核酸脂质体纳米粒LNP制备芯片(鱼骨结构凸起)
图5 ZX-LS-31核酸脂质体纳米粒LNP制备芯片(鱼骨结构凹陷)
图6 ZX-LS-31P核酸脂质体纳米粒LNP制备芯片(鱼骨结构凹陷)
图7 鱼骨结构核酸脂质体纳米粒LNP制备芯片实物图(PDMS微流控芯片)
5. 制备核酸脂质体纳米粒LNP的进样设备
中芯启恒恒压泵(压力驱动微流体进样仪)用于生成稳定无脉冲的液流,其响应时间短,适用于各种要求苛刻的微流体应用。压力控制器由计算机通过 USB 接口控制,使用中芯启恒 FluidicLab Suite 软件,可以生成复杂的压力或流速曲线 ( 如正弦波,方波,三角波等 )。配套的中芯启恒FluidicLab Suite 软件可记录并输出压力控制器产生的数据。
图8 中芯启恒恒压泵连接示意图
将压力控制器 1 通道与 4 mm PU 管一端连接,然后把连接储液池的 PTFE 管与流量传感器的“in”接口相连,流量传感器的另一端“out”连接 PTFE 管作为液体输出口,最终组装出设备如图1所示。其余3个通道的连接与之相同。进样原理是:以气推液,气体管在储液池页面以上,出液管在储液池液面以下,气体挤压液面,将液体从出液管挤出,实现进样操作。
5.1 恒压泵(压力驱动微流体进样仪)特点:
压力输出波动小于 0.02% ,响应时间 9 ms,无论恒流输出还是变流 速输出,均可应对自如。
卓越的性能:
1)内置压力传感器,高速 PID 控制,压力输出波动:< 0.02%
2) 响应时间:< 9 ms
3)可安装四个独立的压力输出通道 多种压力输出范围(0-0.2 bar,0-2 bar, 0-8 bar, -1-1 bar, -1-6 bar),并可根据客 户要求定制
4)可设置恒流输出(需接流量传感器)和压力波形输出
5.2 压力控制器软件的使用:
图9中芯启恒恒压泵压力控制窗口
如图9所示,可以直接设置各通道的压力参数,每个通道的压力参数可以设置不同。
图10中芯启恒恒压泵压力控制设置窗口
如图10所示,用户可以设置实时压力的读取间隔,其最低设定值为 0.001s ( 实测读取时最短读取周期约为 0.02 s,低于此间隔的数据是重复的 )。备注信息,压力校准和同步增减系数设置(多路压力协同输出)也可以在此操作。
6. 制备的核酸脂质体纳米粒LNP的粒径范围
如图11所示,利用带鱼骨结构的微流控芯片制备的核酸脂质体纳米粒LNP平均粒径在142nm左右。
图11 制备的核酸脂质体纳米粒LNP的粒径范围
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