什么是核酸脂质纳米粒介绍及影响其粒径的因素

1. 什么是核酸脂质纳米粒（LNP）？

由于疫情影响，mRNA疫苗、核酸药物等获得了更多的关注。现在mRNA疫苗、核酸药物多是采用脂质纳米颗粒（LNP）来实现对mRNA等核酸分子的递送的，辉瑞、Moderna等上市的mRNA疫苗以及早期的针对罕见病遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性或hATTR（一种神经病变或神经损伤）的RNA类药物Onpattro都是采用了脂质纳米颗粒来递送各自的核酸药物。

脂质纳米粒的膜材主要由磷脂与胆固醇构成。脂质纳米材料具有独特的亲水、亲油“两亲性”，使得在同一药物里同时添加亲油亲水药物和活性成分成为了可能。

不同核酸递送系统的脂质配比是非常相似的，LNP的配方中可离子化阳离子脂质占50%，剩下10%是中性脂质，38-40%是胆固醇。脂质纳米颗粒（LNP）模拟细胞膜形成细胞，直径只有100纳米左右，成分包括中性脂质、阳离子脂质、胆固醇、PEG-脂质。核酸药物与普通化学药物的明显区别是核酸有数量庞大的磷酸根，因而呈负电，使用可离子化阳离子脂质的LNP可以更好的包裹核酸药物。阳离子脂质有一个带铵根的亲水端，在酸性下与氢离子结合呈正电，借助两者的静电吸附，就能够将核酸包裹在脂质纳米粒中。当LNP被细胞内吞后，可离子化阳离子脂质会在酸性环境下离子化，破坏内涵体膜，从而实现LNP的内涵体逃逸。

图1 核酸脂质纳米粒的药代动力学过程（图片来源于网络）

2. 核酸脂质纳米粒（LNP）的制备方法

目前常用的脂质纳米颗粒制备方法主要有薄膜水化法、挤出法、均质法等。近年来，越来越多的研究人员倾向于采用微流控混合技术来制备核酸脂质纳米颗粒，该方法相对简便快速，条件温和，同时容易实现生产放大。该方法可以较好的实现mRNA-LNP的良好制备，其结果一致性良好，粒径结果合适，且具有极低的PDI值，证实其分散性较好，并且包封效果可达90%以上。

微流控技术基本原理：将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后，将两相溶液注入制备系统的两条入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂质的乙醇溶液，通过两相的快速混合，完成核酸脂质纳米颗粒的合成。 改变流体注入速度和比率，可以控制脂质纳米颗粒的粒径大小。常见的微流控水相、有机相合成比3:1。

3. 影响核酸脂质纳米粒（LNP）粒径的因素

（1）微流控芯片的混合结构。

微流控(Microfluidic,MF)是指在纳米或微米级别的通道中操控微量流体的技术。流体在微小尺寸的流道内呈层流状态,且流体运动行为高度可控。与传统纳米粒制备方法相比,MF技术可以通过改变芯片形状、流体流速、流量、混合顺序等因素精密控制层流液体混合效应,是一种有效的合成粒径均一、批次质量可控的纳米粒的工程学工具。一般来讲当芯片的混合结构确定后，这个芯片可以产生的脂质纳米粒的粒径范围大致确定，但是也会受到以下因素的影响：

（2）核酸脂质纳米粒（LNP）的试剂体系，正负电荷的比例不合理会导致粒径过大。

在核酸脂质纳米颗粒合成时，正电荷与负电荷的数量比将影响到纳米粒子的稳定性、电位等性能。正电荷通常为具有可电离铵根（N）的阳离子脂质，而负电荷则为带有大量磷酸根（P）的核酸分子，两者可通过静电吸附的方式结合在一起。两者不合理的比例可能会导致粒径过大。核酸递送脂质纳米颗粒一般由以下辅料组成：

1) 阳离子脂质：与带负电的 mRNA 结合，可高效包载核酸药物，同时提供正电荷，与带负电荷的mRNA复合，有助于内涵体逃逸，mRNA体内转染，可离子化脂质具有pH敏感性。具体产品有DOTAP,Cl，DLin-MC3-DMA，DC-CHOL等。

2) 胆固醇：稳定LNP结构，调节膜流动性，提高粒子稳定性。

3) 辅助型脂质：常用DOPE，稳定粒子，破坏内涵体稳定性，提高核酸递送效率。

4) 聚乙二醇化磷脂：提高粒子稳定性，减少粒子在体内与血浆蛋白的结合，延长体循环时间。例如DMG-PEG2000，DSPE-MPEG2000（药用注射级）等。

5) 稳定剂蔗糖或海藻糖，提高LNP和mRNA疫苗的稳定性，防止脂质黏性过大。

（3）流速比：一般认为水相比例越高，粒径越小

在微流控芯片结构和试剂体系确定后，一般认为：水相比例越高，意味着同时流经的有机相更少，因而能够形成纳米粒子的“原料”——脂质——的数量就越少，因而围成球状后的体积也相应更小。但在不断增加水相比例后，有机相含量变化变得不那么剧烈，因而对粒径的影响也逐渐减弱。

（4）总流速：一般认为通常流速越高，粒径越小，但不可无限制缩小

想要调整粒径大小，除了调节水相和有机相的流速比，也可以调节总流速。在纳米药物制备系统的芯片中，用于合成反应的流道长度是固定的，越高的流速意味着更为短暂的反应时间，两相形成层流进行成分交换、反应的时间也更为短暂，可以理解为用于包裹的脂质数量更少，导致粒径更小。之所以称为“部分依靠”，是因为再少的脂质，都有自组装的趋势，最终都需要形成稳定的球状结构，形成稳态，因而对于固定的配方，在流速较小的时候提升流速，粒径变化相对明显，而流速越快，则粒径变化越不明显。

（5）前后废液过少会影响粒径

无论采用什么动力源进样，在进样开始时会有一段加速过程，在进样结束时，会有一段减速过程，或者管路里存有背压。在速度变化期间，液体的流动速度不稳定，导致粒径持续变化，影响最终结果。为了保证最终成品的粒径均一，就需要剔除这两段液体。

（6）成品溶液要及时采用超滤或透析方法去除不需要的有机溶剂，否则产品的粒径会发生变化。

以常见的微流控水相、有机相合成比3:1为例，有机相溶剂常使用无水乙醇，在混合后仍然有高达25%的含量。高浓度的乙醇将逐渐破坏溶液中的纳米粒子，使其粒径逐渐增大。有的甚至能在短短数小时内由50 nm增长到200 nm，严重影响实验结果和方案评估。

4. 核酸脂质纳米粒（LNP）粒径的测定方法

粒径测定通常使用动态光散射粒度仪（DLS），需要注意的是，不同品牌的粒度仪对于同一个样品的检测结果会有些许差别。另外，在检测过程中，需要注意待测液体的浓度和温度对结果造成的影响：一般而言，浓度过高的液体因散射光被大量粒子阻挡，所测出的粒径偏差较大；而温度决定了粒子布朗运动强度，溶液温度没有平衡前也会影响粒径的检测结果。

5. 微混合脂质体芯片的参数如下：

以下芯片可以为研究者提供基本的原理验证。

微混合脂质体芯片的实物展示：

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